Pregabalin bukan agonis reseptor GABAA atau GABAB.
Pregabalin adalah gabapentinoid dan bertindak dengan menghambat saluran kalsium tertentu. Secara khusus, ini adalah ligan dari situs subunit α2δ tambahan dari saluran kalsium yang bergantung pada tegangan (VDCC) tertentu, dan dengan demikian bertindak sebagai penghambat VDCC yang mengandung subunit α2δ. Ada dua subunit pengikat obat α2δ, α2δ-1 dan α2δ-2, dan pregabalin menunjukkan afinitas yang serupa (dan karenanya kurangnya selektivitas antara) kedua situs ini. Pregabalin selektif dalam berikatan dengan subunit α2δ VDCC. Terlepas dari kenyataan bahwa pregabalin adalah analog GABA, pregabalin tidak berikatan dengan reseptor GABA, tidak diubah menjadi GABA atau agonis reseptor GABA lainnya secara in vivo, dan tidak secara langsung memodulasi transportasi atau metabolisme GABA. Namun, pregabalin diketahui menghasilkan peningkatan ekspresi asam L-glutamat dekarboksilase (GAD) otak yang bergantung pada dosis, enzim yang bertanggung jawab untuk mensintesis GABA, dan karenanya mungkin memiliki beberapa efek GABAergik tidak langsung dengan meningkatkan kadar GABA di otak. Saat ini tidak ada bukti bahwa efek pregabalin dimediasi oleh mekanisme apa pun selain penghambatan VDCC yang mengandung α2δ. Oleh karena itu, penghambatan VDCC yang mengandung α2δ-1 oleh pregabalin tampaknya bertanggung jawab atas efek antikonvulsan, analgesik, dan ansiolitiknya.
Asam α-amino endogen L-leusin dan L-isoleusin, yang struktur kimianya sangat mirip dengan pregabalin dan gabapentinoid lainnya, merupakan ligan subunit α2δ VDCC dengan afinitas serupa dengan gabapentinoid (misalnya, IC50 = 71 nM untuk L- isoleusin), dan terdapat dalam cairan serebrospinal manusia pada konsentrasi mikromolar (misalnya, 12,9 μM untuk L-leusin, 4,8 μM untuk L-isoleusin). Telah diteorikan bahwa mereka mungkin merupakan ligan endogen dari subunit dan mereka mungkin secara kompetitif memusuhi efek gabapentinoid. Oleh karena itu, meskipun gabapentinoid seperti pregabalin dan gabapentin memiliki afinitas nanomolar terhadap subunit α2δ, potensinya secara in vivo berada pada kisaran mikromolar rendah, dan persaingan untuk mengikat asam L-amino endogen dikatakan bertanggung jawab atas perbedaan ini.

Pregabalin ditemukan memiliki afinitas 6 kali lipat lebih tinggi dibandingkan gabapentin terhadap VDCC yang mengandung subunit α2δ dalam sebuah penelitian. Namun, penelitian lain menemukan bahwa pregabalin dan gabapentin memiliki afinitas serupa untuk subunit α2δ-1 rekombinan manusia (Ki = 32 nM dan 40 nM, masing-masing). Bagaimanapun, pregabalin 2 sampai 4 kali lebih kuat dibandingkan gabapentin sebagai analgesik dan, pada hewan, nampaknya 3 sampai 10 kali lebih kuat dibandingkan gabapentin sebagai antikonvulsan.